Zinc Finger Nuclease – un aperçu

1.3 Aperçus et améliorations des études de spécificité ZFN

ZFN (Kim, Cha et Chandrasegaran, 1996) sont des fusions dimères du non spécifique FokI domaine de clivage de l’endonucléase de restriction (Hirsch, Wah, Dorner, Schildkraut et Aggarwal, 1997) avec des domaines de liaison à l’ADN en doigt de zinc (3.3.UNE). le FokI le domaine de clivage doit se dimériser pour être actif ; par conséquent, les ZFN ne peuvent cliver l’ADN qu’après avoir dimérisé et ponté deux demi-sites (Vanamee, Santagata et Aggarwal, 2001) qui sont séparés par une séquence d’espacement d’ADN non spécifiée. La spécificité du site cible est donc déterminée par deux domaines de liaison à l’ADN en doigt de zinc, chacun étant constitué de trois répétitions en tandem ou plus de doigts de zinc individuels. Chaque doigt de zinc individuel reconnaît trois paires de bases (Beerli, Segal, Dreier et Barbas, 1998), et un domaine de liaison à l’ADN en doigt de zinc reconnaît au total au moins neuf paires de bases. Par conséquent, au total, les ZFN reconnaissent les sites qui sont au moins 18 pb long (sans compter l’entretoise).

Graphique 3.3. Architecture des nucléases programmables ZFN, TALEN et Cas9. (A) Un monomère ZFN est une fusion d’un FokI domaine de clivage de la nucléase (violet ; gris foncé dans la version imprimée) à un ensemble de doigts de zinc adjacents (quatre, dans cet exemple) ciblant chacun trois paires de bases (pour un total de 12 paires de bases reconnues, dans cet exemple). Deux monomères ZFN différents se lient à leurs demi-sites correspondants, permettant FokJe dimérisation et clivage de l’ADN entre les demi-sites. (B) Un monomère TALEN contient un domaine N-terminal suivi d’un ensemble de répétitions TALE (boîtes pleines), un domaine C-terminal et un FokI domaine de clivage de la nucléase (violet ; gris foncé dans la version imprimée). Les 12e et 13e acides aminés (le RVD, rouge ; gris foncé dans la version imprimée) de chaque répétition TALE reconnaissent une paire de bases d’ADN spécifique. Deux monomères TALEN différents lient leurs demi-sites correspondants, permettant FokJe dimérisation et clivage de l’ADN entre les demi-sites. (C) La protéine Cas9 (jaune; gris clair dans la version imprimée) se lie à l’ADN cible en complexe avec un seul ARN guide (sgRNA, vert; gris clair dans la version imprimée). le S. pyogenes La protéine Cas9 et le complexe sgRNA reconnaissent la séquence PAM NGG (bleu ; gris clair dans la version imprimée). Les triangles noirs indiquent les points de clivage dans l’ADN cible à trois bases du PAM sur les deux brins d’ADN.

La spécificité de liaison à l’ADN des ZFN est programmée par les doigts de zinc individuels composites. Chaque doigt de zinc individuel est constitué d’un pli ββα compact avec un noyau hydrophobe stabilisé par un ion zinc coordonné par deux cystéines et deux histidines. Bien que de nombreux progrès aient été signalés dans la conception de doigts de zinc pouvant cibler n’importe quel triplet d’ADN, principalement par Barbas, Joung, Klug, Pabo et leurs collègues respectifs (Beerli et al., 1998 ; Choo, Sanchez-Garcia et Klug, 1994 ; Dreier, Beerli, Segal, Flippin et Barbas, 2001 ; Dreier, Segal et Barbas, 2000 ; Dreier et al., 2005 ; Maeder et al., 2008 ; Barres d’armature et Pabo, 1994 ; Sander et al., 2011 ; Wu, Yang et Barbas, 1995), la conception des domaines multi-doigts d’un ZFN nécessite souvent une sélection (Greisman et Pabo, 1997 ; Isalan, Klug et Choo, 2001 ; Maeder et al., 2008) ou des approches computationnelles (Sander et al., 2011) telles que celles décrites par Joung et ses collègues.

Études initiales de la spécificité de ZFN utilisant SELEX sur des domaines de liaison à doigt de zinc seuls (Perez et al., 2008) ont suggéré que les ZFN sont hautement spécifiques, en particulier lorsque des versions hétérodimères, développées pour la première fois par Rebar et Cathomen, sont utilisées (Miller et coll., 2007 ; Szczepek et al., 2007). Les ZFN hétérodimères ont des mutations dans le FokI domaine de clivage qui ne permet qu’une dimérisation entre différents monomères ZFN (Doyon et al., 2011 ; Miller et coll., 2007 ; Szczepek et al., 2007). Alors que de nombreux sites hors cible CCR5 ZFN ont été identifiés (Gabriel et al., 2011 ; Pattanayak et coll., 2011, Sander et coll., 2013), à ce jour, aucune toxicité n’a été rapportée dans les essais cliniques (Tebas et al., 2014).

En plus d’identifier les sites génomiques hors cible, in vitro les sélections sur deux ZFN différentes par Liu et ses collègues ont également mis en lumière plusieurs propriétés générales de la spécificité des ZFN (Pattanayak et al., 2011). Comme d’autres enzymes, les ZFN présentent une spécificité dépendante de la concentration, de sorte qu’un plus grand nombre de sites hors cible peut être coupé lorsque le ZFN est à une concentration plus élevée. En général, les sites hors cible ZFN avec un petit nombre de mutations (par exemple, pour le ZFN CCR5, trois mutations ou moins sur 24 paires de bases cibles) peuvent être reconnus et clivés. Bien qu’aucune préférence de séquence dans la région d’espacement entre les demi-sites n’ait été observée, les sites avec des espaceurs de quatre et sept paires de bases défavorisés étaient généralement reconnus avec une plus grande spécificité que les sites avec les espaceurs de cinq et six paires de bases plus favorisés. Enfin, les sites hors cible avec plusieurs mutations dans un demi-site contiennent probablement peu ou pas de mutations dans l’autre demi-site. Toutes ces observations sont cohérentes avec un modèle dans lequel l’énergie de liaison ZFN:ADN doit atteindre un seuil minimum pour que le clivage se produise, et que l’activité de clivage hors cible résulte d’un excès d’énergie de liaison entre un ZFN et l’ADN qui peut tolérer l’énergie pénalité encourue par les mésappariements protéine-ADN.